•结核病耐药专题研究•
【编者按】 结核病是目前全球范围内头号传染病杀手，也是全球范围内导致死亡的十大疾病之一。2015年，世界卫生组织（WHO）提出了“终止结核病策略”（End-TB），其目标是2035年在全球终止结核病流行。但近年来由于结核分枝杆菌耐药增多而导致结核病出现复燃之势。据WHO统计，目前全球约有5 000万人受到耐药分枝结核杆菌感染，我国结核分枝杆菌耐药率约为37.8%，结核病耐药使结核病防控形势变得严峻。本期“结核病耐药专题研究”栏目中杨芳等通过实证研究探讨了初治肺结核患者耐药情况、耐药危险因素、耐药基因及其辅助诊断技术；谭旎等、郭艳等、刘柏杉等、何兴等、唐正洪等均以耐药基因为切入点，分别系统地综述了结核分枝杆菌耐丙硫异烟胺、对氨基水杨酸、氯法齐明、环丝氨酸及利奈唑胺相关基因的研究进展，旨在为有效防控耐药结核病提供参考。敬请关注！
初治肺结核患者耐药情况、耐药危险因素、耐药基因及其辅助诊断技术研究
杨芳1，2，张磊1
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31501112）
1.710032 陕西省西安市，空军军医大学流行病学教研室 2.710100陕西省西安市胸科医院控感科
通信作者：张磊
杨芳，张磊.初治肺结核患者耐药情况、耐药危险因素、耐药基因及其辅助诊断技术研究［J］.实用心脑肺血管病杂志，2018，26（11）：5-10.
YANG F，ZHANG L.Drug resistance situation，risk factors for drug resistance，drug resistance related genes and aided diagnostic techniques in untreated patients with pulmonary tuberculosis［J］.Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2018，26（11）：5-10.
结核病是威胁人类健康的重大传染病之一，近年来由于结核分枝杆菌耐药增多而导致结核病出现复燃之势［1］。据世界卫生组织（WHO）统计，目前全球约有5 000万人受到耐药结核分枝杆菌感染［2］，我国结核分枝杆菌耐药率约为37.8%，且初治结核病患者结核分枝杆菌耐药率虽低于复治结核病患者，但耐药率仍在35%左右［3］，因此初治结核病患者结核分枝杆菌耐药已成为重要的公共卫生问题之一。近年研究发现，在初治肺结核患者中不仅检测到对一线抗结核药物如利福平、异烟肼等耐药的菌株，还检测到对二线抗结核药物耐药的菌株［4］，提示耐药结核分枝杆菌于人际间传播速度加快，给结核病的防控工作带来了新的挑战。本研究旨在探讨初治肺结核患者耐药情况、耐药危险因素、耐药基因及其辅助诊断技术，为结核病的有效防控及减少结核分枝杆菌耐药提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2015年7—12月西安市胸科医院收治的初治肺结核患者478例，均未进行过抗结核治疗或治疗时间<1个月，痰培养结核分枝杆菌阳性并完成药敏试验；排除标准：伴有严重心血管疾病、免疫系统疾病及糖尿病者。所有患者中男316例，女162例；年龄6~91岁，中位年龄36岁（Q1 31岁，Q4 62岁）；常住人口450例，流动人口28例；城镇居民211例，农村居民267例。
1.2 痰培养及药敏试验 采用美国BD公司BACTEC MGIT 960系统进行痰培养及药敏试验，其中药敏试验采用美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的比例法（method of proportion，MOP），检测药物包括4种一线抗结核药物（包括异烟肼、利福平、乙胺丁醇及链霉素）和7种二线抗结核药物（包括左氧氟沙星、利福喷丁、莫西沙星、对氨基水杨酸钠、卷曲霉素、丙硫异烟胺、阿米卡星），判断临界值为1%。
1.3 耐药类型判断标准 结核分枝杆菌对1种一线抗结核药物耐药定义为单耐药结核病（MR-TB），对1种以上一线抗结核药物耐药但不包括同时对异烟肼和利福平耐药定义为多耐药结核病（PR-TB），至少同时对异烟肼和利福平耐药定义为耐多药结核病（MDR-TB），对异烟肼和利福平耐药同时对氟喹诺酮类药物及二线抗结核药物（卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素）中的至少1种耐药定义为广泛耐药结核病（XDR-TB）。本研究将出现MR-TB、PR-TB、MDR-TB、XDR-TB中的任1种者统称为耐药肺结核。
1.4 耐药相关因素 于患者就诊时采用标准问卷收集其人口学特征，包括性别、年龄、人口类型、受教育程度、家庭人均月收入、身高、体质量并计算体质指数（BMI），以BMI<18.5 kg/m2为偏瘦，18.5~23.9 kg/m2为正常，24.0~27.9 kg/m2为超重/肥胖；分析患者临床特征，包括咳嗽时间、咯血或血痰、双肺受累肺野数及肺结核患者接触史；所有患者进行胸部X射检查并由专业医师判断双肺受累情况，以第2、4肋骨前端下缘水平线为界，将双肺分为上、中、下3野，记录双肺受累肺野数。
1.5 耐药基因检测及辅助诊断技术 （1）采用基因芯片法检测利福平耐药相关rpoB基因、异烟肼耐药相关katG/inhA基因突变情况，所用仪器为晶芯 RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪（博奥生物集团有限公司生产）。（2）采用荧光探针法进行双通道聚合酶链反应（PCR），扩增结核分枝杆菌DNA片段并采用恒温扩增法检测结核分枝杆菌RNA，TB-SAT试剂盒购自上海仁度生物科技有限公司，所用仪器为ThermoFisher生产的Veriti仪，以扩增CT值≥40为阳性。（3）采用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行结核感染T细胞检测，结核分枝杆菌免疫反应检测值〔TB（T-N）〕≥14为阳性，TB-IGRA试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司。（4）采用蛋白芯片法检测结核抗体三项，包括LAM抗体、38DKa抗体及16DKa抗体，TB03A试剂盒购自南京大渊生物技术工程有限责任公司。
1.6 统计学方法 采用EpiData 3.1软件建立数据库并双人双机录入数据，采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以百分数表示，采用χ2检验或Fisher's确切概率法；采用Kappa值判断耐药基因检测与药敏试验的一致性，Kappa值≤0.20为一致性极低，0.21~0.40为一致性一般，0.41~0.60为一致性中等，0.61~0.80为一致性较高，0.81~1.00为几乎完全一致；初治肺结核患者耐药的危险因素分析采用多因素Logistic回归分析（逐步法）。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 耐药情况 478例患者中126例耐药，耐药率为26.4%。478例患者中对一线抗结核药物异烟肼耐药64例（13.4%），利福平耐药33例（6.9%），乙胺丁醇耐药20例（4.2%），链霉素耐药75例（15.7%）；对二线抗结核药物左氧氟沙星耐药28例（5.9%），利福喷丁耐药28例（5.9%），莫西沙星耐药23例（4.8%），对氨基水杨酸钠耐药21例（4.4%），卷曲霉素耐药7例（1.5%），丙硫异烟胺耐药2例（0.4%），阿米卡星耐药2例（0.4%）；MR-TB 50例（10.5%），MDR-TB 30例（6.3%），XDR-TB 21例（4.4%），其他25例（5.2%）。
2.2 耐药危险因素 不同耐药情况患者男性比例、人口类型、家庭人均月收入、BMI、咯血或血痰发生情况、肺结核患者接触史比较，差异无统计学意义（P>0.05）；不同耐药情况患者年龄、受教育程度、咳嗽时间≥3周者所占比例、双肺受累肺野数比较，差异有统计学意义（P<0.05，见表1）。将年龄（赋值：<30岁=0，30~59岁=1，≥60岁=2）、受教育程度（赋值：初中及以下=0，高中/中专=1，大学及以上=2）、咳嗽时间≥3周（赋值：否=0，是=1）、双肺受累肺野数（赋值：1~5个=0，6个=1）作为自变量，将药敏试验结果（赋值：敏感=0，耐药=1）作为因变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示年龄、双肺受累肺野数是初治肺结核患者耐药的危险因素（P<0.05，见表2）。
表2 初治肺结核患者耐药相关因素的多因素Logistic回归分析结果
Table 2 Multivariate Logistic regression analysis on related factors of drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis
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变量
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β
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SE
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Wald χ2值
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P值
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OR（95%CI）
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年龄（以<30岁为对照）
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|
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30~59岁
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0.687
|
0.248
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7.706
|
0.006
|
1.988（1.224，3.231）
|
|
≥60岁
|
0.645
|
0.313
|
4.242
|
0.039
|
1.906（1.032，3.521）
|
|
双肺胸片受累肺野数
|
0.713
|
0.231
|
9.534
|
0.002
|
2.040（1.298，3.209）
|
2.3 耐药基因检测结果 478例患者中210例行利福平耐药相关rpoB基因、异烟肼耐药相关katG/inhA基因检测，结果显示利福平耐药相关rpoB基因突变诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为83.3%，特异度为99.0%，阳性预测值为83.3%，阴性预测值为99.0%，Kappa值为0.823；异烟肼耐药相关katG/inhA基因突变诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为58.6%，特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%，阴性预测值为93.8%，Kappa值为0.709（见表3）。
表3 利福平耐药相关rpoB基因、异烟肼耐药相关katG/inhA基因突变对初治肺结核患者耐药的诊断价值（例）
Table 3 Diagnostic value of rifampin-resistant related rpoB and isoniazid-resistant related katG/inhA gene mutation on drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis
|
利福平耐药相关rpoB基因
|
药敏试验结果
|
合
计
|
|
异烟肼耐药相关katG/inhA基因
|
药敏试验结果
|
合
计
|
|
耐药
|
敏感
|
耐药
|
敏感
|
|
突变
|
10
|
2
|
12
|
|
突变
|
17
|
0
|
17
|
|
非突变
|
2
|
196
|
198
|
|
非突变
|
12
|
181
|
193
|
|
合计
|
12
|
198
|
210
|
|
合计
|
29
|
181
|
210
|
2.4 辅助诊断技术检测结果
2.4.1 双通道PCR 37例患者双通道PCR结核分枝杆菌RNA扩增结果缺失，双通道PCR结核分枝杆菌RNA扩增诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为75.2%，特异度为34.9%，阳性预测值为27.5%，阴性预测值为81.1%，Kappa值为0.449；10例患者双通道PCR结核分歧杆菌DNA扩增结果缺失，双通道PCR结核分歧杆菌DNA扩增诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为82.4%，特异度为29.4%，阳性预测值为29.9%，阴性预测值为82.1%，Kappa值为0.436（见表4）。
表4 双通道PCR结核分枝杆菌RNA、DNA扩增对初治肺结核患者耐药的诊断价值（例）
Table 4 Diagnostic value of Mycobacterium tuberculosis RNA and DNA amplification on drug resistance in dual-channel PCR in untreated patients with pulmonary tuberculosis
|
双通道PCR结核分枝杆菌RNA扩增
|
药敏试验结果
|
合
计
|
|
双通道结核分枝
杆菌DNA扩增
|
药敏试验结果
|
合
计
|
|
耐药
|
敏感
|
耐药
|
敏感
|
|
阳性
|
82
|
216
|
298
|
阳性
|
103
|
242
|
345
|
|
阴性
|
27
|
116
|
143
|
|
阴性
|
22
|
101
|
123
|
|
合计
|
109
|
332
|
441
|
合计
|
125
|
343
|
468
|
2.4.2 结核感染T细胞检测 71例患者结核感染T细胞检测结果缺失；结核感染T细胞检测诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为71.4%，特异度为22.7%，阳性预测值为26.0%，阴性预测值为67.7%，Kappa值为0.361（见表5）。
表5 结核感染T细胞检测对初治肺结核患者耐药的诊断价值（例）
Table 5 Diagnostic value of T cell test for tuberculosis infection on drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis
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结核感染T细胞检测
|
药敏试验结果
|
合计
|
|
耐药
|
敏感
|
|
阳性
|
80
|
228
|
308
|
|
阴性
|
32
|
67
|
99
|
|
合计
|
112
|
295
|
407
|
2.4.3 结核抗体三项 35例患者结核抗体三项结果缺失。LAM抗体诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为65.3%，特异度为39.7%，阳性预测值为28.2%，阴性预测值为75.9%，
Kappa值为0.465；38DKa抗体诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为69.5%，特异度为43.7%，阳性预测值为30.9%，阴性预测值为79.8%，Kappa值为0.506；16DKa抗体诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为2.5%，特异度为92.2%，阳性预测值为12.0%，阴性预测值为72.5%，Kappa值为0.691（见表6）。
表6 结核抗体三项对初治肺结核患者耐药的诊断价值（例）
Table 6 Diagnostic value of triune tuberculosis antibodies on drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis
|
LAM抗体
|
药敏试验结果
|
合
计
|
|
38DKa抗体
|
药敏试验结果
|
合
计
|
|
16DKa抗体
|
药敏试验结果
|
合
计
|
|
耐药
|
敏感
|
耐药
|
敏感
|
耐药
|
敏感
|
|
阳性
|
77
|
196
|
273
|
阳性
|
82
|
183
|
265
|
阳性
|
3
|
22
|
25
|
|
阴性
|
41
|
129
|
170
|
|
阴性
|
36
|
142
|
178
|
|
阴性
|
115
|
303
|
418
|
|
合计
|
118
|
325
|
443
|
合计
|
118
|
325
|
443
|
合计
|
118
|
325
|
443
|
3 讨论
遏制耐药结核病的流行是当前形势下控制结核病传播的关键，但耐药结核病对常用抗结核药物耐药、治疗困难、传染风险大，可导致患者经济负担加重，已成为我国公共卫生问题之一［2］。由于初治肺结核患者未服用过抗结核药物或治疗时间<1个月，因此其体内结核分枝杆菌耐药并非药物作用导致，而是直接感染了耐药结核分枝杆菌 ［5］。了解初治肺结核患者耐药情况、耐药类型对了解肺结核传播、流行规律并制定有针对性的防控措施具有重要意义。
本研究结果显示，478例初治肺结核患者耐药率为26.4%，对一线抗结核药物异烟肼耐药率为13.4%，利福平耐药率为6.9%，与既往文献报道相似［4，6-7］。MDR-TB具有治疗成功率低、治疗费用昂贵、致死率高、治疗药物毒副作用大等特点，是耐药结核病研究热点之一［8-9］。本研究结果显示，478例初治肺结核患者中检出MDR-TB 30例（6.3%），高于黄静静等［4］研究结果，提示该地区应注意MDR-TB的流行。
研究表明，年龄较大、存在基础疾病、免疫力低下者感染耐药结核分枝杆菌的风险较大［10］。本研究进行的单因素分析结果显示，不同耐药情况患者年龄、受教育程度、咳嗽时间≥3周者所占比例、双肺受累肺野数间存在差异，进一步行多因素Logistic回归分析发现，年龄、双肺受累肺野数是初治肺结核患者耐药的危险因素，与FURIN等［11］研究结果一致；本研究未发现不同药敏试验结果患者男性比例、人口类型、家庭人均月收入、BMI、咯血或血痰发生情况、肺结核患者接触史间存在差异，可能与样本量较小有关，但需要指出的是，126例耐药肺结核患者中年龄<30岁者所占比例为36.5%，而237例年龄<30岁的初治肺结核患者耐药肺结核发生率为19.4%，提示初治肺结核患者应积极行药敏试验及耐药筛查并尽量覆盖一线和二线抗结核药物，而不应依据年龄、生活习惯等忽视耐药肺结核的筛查。
近年来，随着基因测序技术发展，结核分枝杆菌耐药基因检测得以快速推广应用。本研究结果显示，利福平耐药相关rpoB基因诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为83.3%，特异度为99.0%，阳性预测值为83.3%，阴性预测值为99.0%，Kappa值为0.823，提示rpoB基因突变对利福平耐药的诊断价值较高，基因检测技术有望成为早期发现耐药结核分枝杆菌的有力手段［12］；异烟肼耐药相关katG/inhA基因突变诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为58.6%，特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%，阴性预测值为93.8%，Kappa值为0.709，低于耿红等［13］研究结果，提示katG/inhA基因突变对异烟肼耐药的诊断价值一般，或耐异烟肼结核分枝杆菌可能与katG/inhA基因之外的其他基因突变有关，仍需进一步研究证实。
由于结核分枝杆菌痰培养所需时间较长，因此双通道PCR、结核感染T细胞检测、结核抗体三项等结核分枝杆菌检测技术亦常应用［14-15］。本研究结果显示，双通道PCR结核分枝杆菌RNA扩增诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为75.2%，特异度为34.9%，阳性预测值为27.5%，阴性预测值为81.1%，Kappa值为0.449；双通道PCR结核分歧杆菌DNA扩增诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为82.4%，特异度为29.4%，阳性预测值为29.9%，阴性预测值为82.1%，Kappa值为0.436；结核感染T细胞检测诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为71.4%，特异度为22.7%，阳性预测值为26.0%，阴性预测值为67.7%，Kappa值为0.361；LAM抗体诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为65.3%，特异度为39.7%，阳性预测值为28.2%，阴性预测值为75.9%，Kappa值为0.465；38DKa抗体诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为69.5%，特异度为43.7%，阳性预测值为30.9%，阴性预测值为79.8%，Kappa值为0.506；16DKa抗体诊断初治肺结核患者耐药的灵敏度为2.5%，特异度为92.2%，阳性预测值为12.0%，阴性预测值为72.5%，Kappa值为0.691，提示双通道PCR、结核感染T细胞检测、结核抗体三项对初治肺结核患者耐药的诊断价值一般，因此应注意结合地区耐药结核病流行规律及结核分枝杆菌辅助诊断技术的灵敏度、特异度等，以提高耐药结核分枝杆菌检出率。
综上所述，初治肺结核患者耐药率为26.4%，MDR-TB检出率为6.3%，应注意MDR-TB的流行；年龄、双肺受累肺野数是初治肺结核患者耐药的危险因素，应加以重视并注意耐药筛查；rpoB基因突变对利福平耐药的诊断价值较高，但katG/inhA基因突变对异烟肼耐药的诊断价值一般，双通道PCR、结核感染T细胞检测、结核抗体三项对初治肺结核患者耐药的诊断价值亦一般，需结合地区耐药结核病流行规律选择应用；但本研究为单中心研究且样本量有限、部分患者信息不完整，存在一定选择偏倚，结论仍需扩大样本量、采用规范化的样本处理方案等进一步证实。
作者贡献：杨芳负责数据处理、分析、撰写论文；张磊负责研究设计与实施、质量监督、审校。
本文无利益冲突。
参考文献
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（收稿日期：2018-09-05；修回日期：2018-11-10）
（本文编辑：鹿飞飞）