•结核病耐药专题研究•
结核分枝杆菌耐利奈唑胺相关基因研究进展
唐正洪，陈玲
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81760003）
563003贵州省遵义市，遵义医学院附属医院呼吸二科
通信作者：陈玲
唐正洪，陈玲.结核分枝杆菌耐利奈唑胺相关基因研究进展［J］.实用心脑肺血管病杂志，2018，26（11）：28-31.
TANG Z H，CHEN L.Progress on drug resistance related genes of Mycobacterium tuberculosis to linezolid［J］.Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2018，26（11）：28-31.
据统计，结核病是2017年全球范围内致死率最高的单病种传染病，约160万例患者因结核病而死亡，其中约23万例患者死于耐多药结核病（MDR-TB）或耐利福平结核病（RR-TB）。MDR-TB及RR-TB均需采用二线抗结核药物治疗，但整体治疗成功率仅为55%［1］。利奈唑胺属恶唑烷酮类抗生素，是治疗MDR-TB的二线核心抗结核药物之一［1］。最初，恶唑烷酮类抗生素作为植物杀菌剂使用，之后人们发现利奈唑胺衍生物具有广谱抗菌作用，因此美国食品药品监督局（FDA）于2000年批准利奈唑胺作为第1种恶唑烷酮类抗生素用于治疗耐药性G+细菌感染［2］，随后几年才开始用于治疗结核病［3-5］。体外试验和动物实验结果显示，利奈唑胺具有抗结核分枝杆菌作用［6-7］，Meta分析结果及队列研究证实利奈唑胺治疗耐药结核病的疗效较好［6，8-11］，且患者耐受性亦较好［12］，但结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药现象仍不可忽视。本文综述了结核分枝杆菌耐利奈唑胺相关基因，旨在为结核分枝杆菌对利奈唑胺的耐药机制研究提供参考。
1 作用机制
利奈唑胺是一种蛋白合成抑制剂，具有与现有抗结核药物迥异的化学结构及作用机制，与一线抗结核药物及其他二线抗结核药物不存在交叉耐药，有利于有效防控耐药结核病。研究表明，利奈唑胺主要通过与50S核糖体上肽基转移酶活性中心23S位点结合而阻止70S始动复合物形成并干扰结核分枝杆菌蛋白合成［13］，进而发挥抗结核分枝杆菌作用，与其他抗结核药物相比，其抑制结核分枝杆菌蛋白合成的靶位亦不同，因此不易发生自然耐药或与其他抑制结核分枝杆菌蛋白合成的抗结核药物产生交叉耐药。
2 利奈唑胺耐药相关基因
目前已知的可能与结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药相关的基因包括rplC基因（Rv0701）、23S rRNA（Rvnr02）、rplD基因（Rv0702）3种。
2.1 rplC基因 rplC基因ID为888343，全长654 bp，编码结核分枝杆菌生长所需50S核糖体蛋白L3，50S核糖体蛋白L3主要位于50S核糖体亚基表面，是主要的RNA结合蛋白，其主要在23S rRNA的 3'末端附近结合并使50S核糖体完成装配，同时其分支靠近肽基转移酶活性中心，而肽基转移酶活性中心是很多作用于核糖体的抗生素结合位点［14-15］。研究发现，核糖体蛋白L3突变可能改变利奈唑胺与肽基转移酶活性中心结合部位周边结构［16］，因此50S核糖体蛋白L3的变化很可能会导致结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药。目前已发现的rplC基因突变类型主要包括T460C〔赖氨酸（Lys）154精氨酸（Arg）〕和C463G〔丝氨酸（His）155天冬氨酸（Asp〕［7，9，17-23］，多项研究证实耐利奈唑胺结核分枝杆菌存在T460C突变，且绝大多数仅含有T460C突变，但突变频率不尽相同（见表1），且利奈唑胺对包含T460C突变的耐利奈唑胺结核分枝杆菌的最低抑菌浓度（MIC）波动于2~32 μg/ml［7，17-18，23］。有研究表明，利奈唑胺对拥有包含强启动子和突变的rplC（T460C）基因质粒的H37Rv菌株的MIC增加4倍，而利奈唑胺对拥有普通启动子和突变的rplC（T460C）基因质粒的H37Rv菌株的MIC则未发生改变，提示rplC基因表达水平对结核分枝杆菌耐药性有一定影响［15］。
有研究发现，2例新型rplC基因突变患者，突变类型为C463G，利奈唑胺对这2例患者结核分枝杆菌的MIC均为2 μg/ml［7，23］，提示rplC基因C463G突变频率较低，而与rplC基因T460C突变相比，rplC基因C463G突变可能对结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药性的影响较小。近期有研究者在419株对利奈唑胺敏感的结核分枝杆菌中发现1株rplC基因突变菌株，突变类型为A328G（Ser110Gly），其MIC为0.25 μg/ml，但在同时发现的另1株耐利奈唑胺结核分枝杆菌中并未发现rplC基因突变［24］；另有研究发现，1株有T460C突变菌株未产生利奈唑胺耐药［9］，提示rplC基因不同编码区突变对结核分枝杆菌耐药性的影响不同，考虑其原因可能与突变氨基酸的空间结构有关。
既往研究结果显示，耐利奈唑胺结核分枝杆菌rplC基因突变频率为23.5%~100.0%，总体突变频率为54.9%，其中rplC基因T460C总体突变频率为52.9%，是耐利奈唑胺结核分枝杆菌最常见的基因突变类型［7，17-23］，但由于rplC基因T460C突变引起的耐利奈唑胺结核分枝杆菌的MIC波动于2~32 μg/ml，因此仍存在其他影响结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药性的因素，需进一步研究证实。国内研究结果显示，中国人群耐利奈唑胺结核分枝杆菌rplC基因突变频率较低［7，17-23］，而rplC基因C463G突变仅在中国人群中被发现且突变频率较低［7，23］，分析其原因可能与结核病发病率及人种差异有关。
2.2 23S rRNA 23S rRNA基因又称rrl基因，ID为2700466，全长3 138 bp，参与结核分枝杆菌50S核糖体形成，由于利奈唑胺主要通过作用于50S核糖体上肽基转移酶活性中心而发挥作用，因此23S rRNA突变可能导致结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药［25］。目前已发现的23S rRNA基因突变类型包括G2061T、G2270C、G2270T、G2746A、A2810T、C2848A、G2814T、G2294A、C1921T、G2576T［7，9，18-19，23，26］（见表1），其中G2061T突变在多项不同研究中均有发现［7，23，26］，因此G2061T突变可能更具共性，并可能是23S rRNA基因最常见的突变类型。目前研究结果显示，23S rRNA总体突变频率为35.4%，但由于该基因突变类型较多，因此单一类型基因突变频率较低，突变频率最高的G2746A、G2061T突变频率仅为9.8%。
表1 已知的利奈唑胺耐药相关基因突变类型及MIC
Table 1 Known drug resistance related gene mutation types to linezolid and the MIC
|
基因突变类型
|
突变频率（n/N）
|
MIC（μg/ml）
|
参考文献
|
|
rplC基因
|
|
|
|
|
T460C
|
3/5
|
0.5~4.0
|
LEE等［9］
|
|
T460C
|
3/17
|
16~32
|
ZHANG等［7］
|
|
T460C
|
13/13
|
4~16
|
BECKERT等［17］
|
|
T460C
|
15/32
|
>2
|
ZHANG等［18］
|
|
T460C
|
9/10
|
NA
|
ZIMENKOV等［19］
|
|
T460C
|
2/5
|
NA
|
PANG等［20］
|
|
T460C
|
7/7
|
NA
|
胡明豪等［21］
|
|
T460C
|
2/5
|
4、16
|
宗兆婧等［22］
|
|
T460C
|
3/13
|
2、4、16
|
ZONG等［23］
|
|
C463G
|
1/17
|
2
|
ZHANG等［7］
|
|
C463G
|
1/13
|
2
|
ZONG等［23］
|
|
23S rRNA基因
|
|
|
|
|
G2447T
|
1/5
|
16
|
LEE等［9］
|
|
G2057T
|
1/5
|
4
|
LEE等［9］
|
|
G2270C
|
2/32
|
2
|
ZHANG等［18］
|
|
G2270T
|
5/32
|
2
|
ZHANG等［18］
|
|
G2746A
|
8/32
|
2
|
ZHANG等［18］
|
|
A2810T
|
1/32
|
2
|
ZHANG等［18］
|
|
C2848A
|
1/32
|
2
|
ZHANG等［18］
|
|
G2576T
|
1/10
|
16
|
HILLEMANN等［26］
|
|
G2814T
|
1/10
|
NA
|
ZIMENKOV等［19］
|
|
G2294A
|
1/10
|
NA
|
ZIMENKOV等［19］
|
|
C1921T
|
1/10
|
NA
|
ZIMENKOV等［19］
|
|
G2061T
|
4/10
|
32
|
HILLEMANN等［26］
|
|
G2061T
|
2/17
|
32
|
ZHANG等［7］
|
|
G2061T
|
2/13
|
≥16
|
ZONG等［23］
|
|
rplD基因
|
|
|
|
|
G377A
|
1/13
|
≥16
|
ZONG等［23］
|
注：n/N=基因突变菌株/检测菌株，MIC=最低抑菌浓度，NA表示未提及或无相关数据
ZHANG等［18］研究表明，利奈唑胺对含有G2270C、G2270T、G2746A、A2810T、C2848A突变的结核分枝杆菌MIC均为2 μg/ml，提示23S rRNA基因突变若包含G2270C、G2270T、G2746A、A2810T、C2848A突变则可轻微增加利奈唑胺对结核分枝杆菌的MIC。多项研究结果显示，利奈唑胺对23S rRNA基因G2061T突变患者结核分枝杆菌的MIC≥16 μg/ml ［7，23，26］，提示23S rRNA基因G2061T突变对结核分枝杆菌耐利奈唑胺的影响较大；而由于利奈唑胺对不同23S rRNA基因突变类型患者结核分枝杆菌的MIC波动于2~32 μg/ml，因此不同23S rRNA基因突变类型对结核分枝杆菌耐利奈唑胺的影响不尽相同。
2.3 rplD基因 rplD基因ID为888345，全长672 bp，编码结核分枝杆菌生长所需50S核糖体蛋白L4。研究表明，50S核糖体蛋白L4位于肽基转移酶活性中心附近，是50S核糖体的主要组成部分［25］，其最初结合在23S rRNA的5'末端附近，在50S核糖体亚基早期形成过程中具有重要作用，并在组装的50S核糖体亚基中与23S rRNA不同结构域形成接触。有学者在利奈唑胺敏感菌株中发现rplD基因非单核苷酸多态性［7］。ZONG等［23］报道了第1例rplD基因G377A突变〔Arg126His〕患者，并证实利奈唑胺对rplD基因G377A突变的结核分枝杆菌的MIC>16 μg/ml，提示rplD基因突变可能导致结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药；但由于目前仅发现1株rplD基因突变的耐利奈唑胺结核分枝杆菌，因此rplD基因突变与结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药的关系仍需进一步研究证实。
3 小结与展望
综上所述，rplC基因突变频率较高，其中T460C是rplC基因最常见的突变类型，T460C、G2061T、G2576T突变对结核分枝杆菌耐利奈唑胺的影响较大；G2061T是主要的23S rRNA基因突变类型，且与rplC基因T460C突变可能不存在叠加效应；中国人群MDR-TB患者基因型为北京型，更易出现利奈唑胺耐药且耐药性较高［7］，但国外人群北京型与非北京型结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药率相同［3］。
目前，利奈唑胺耐药机制研究取得一定进展，多数研究者认为rplC、23S rRNA基因突变与结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药有关，而虽有研究表明rplD基因突变可导致结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药，但由于该基因突变频率极低，因此仍有待进一步研究证实。此外，目前关于结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药基因的研究样本量均较小，虽然基因突变可以解释部分结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药，但基因突变机制之外还可能存在其他机制，如药物外排泵机制、基因调控机制及其他基因突变机制等，而利奈唑胺作为二线核心抗结核药物，作用机制独特，治疗耐药结核病的前景广阔，因此不应忽视其耐药现象及耐药机制研究，以更有效地防控耐药结核病。
参考文献
［1］World Health Organization.Global Tuberculosis Report 2018［R］.Geneva：WHO，2018.
［2］LEACH K L，BRICKNER S J，NOE M C，et al.Linezolid，the first oxazolidinone antibacterial agent［J］.Ann NYAcad Sci，2011，1222：49-54.DOI：10.1111/j.1749-6632.2011.05962.x.
［3］RICHTER E，RÜSCH-GERDES S，HILLEMANN D.First linezolid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51（4）：1534-1536.DOI: 10.1128/AAC.01113-06.
［4］SANDER P，BELOVA L，KIDAN Y G，et al.Ribosomal and non-ribosomal resistance to oxazolidinones：species-specific idiosyncrasy of ribosomal alterations［J］.Mol Microbiol，2002，46（5）：1295-1304.DOI：10.1046/j.1365-2958.2002.03242.x.
［5］SRIVASTAVA S，MAGOMBEDZE G，KOEUTH T，et al.Linezolid Dose That Maximizes Sterilizing Effect While Minimizing Toxicity and Resistance Emergence for Tuberculosis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2017，61（8）.pii：e00751-17.DOI：10.1128/AAC.00751-17.
［6］COX H，FORD N.Linezolid for the treatment of complicated drug-resistant tuberculosis：a systematic review and meta-analysis［J］.Int J Tuber Lung Dis，2012，16（4）：447-454.DOI：10.5588/ijtld.11.0451.
［7］ZHANG Z，PANG Y，WANG Y，et al.Beijing genotype of Mycobacterium tuberculosis is significantly associated with linezolid resistance in multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis in China［J］.Int J Antimicrob Agents，2014，43（3）：231-235.DOI：10.1016/j.ijantimicag.2013.12.007.
［8］SOTGIU G，CENTIS R，D'AMBROSIO L，et al.Efficacy，safety and tolerability of linezolid containing regimens in treating MDR-TB and XDR-TB：systematic review and meta-analysis［J］.Eur Respir J，2012，40（6）：1430-1442.DOI：10.1183/09031936.00022912.
［9］LEE M，LEE J，CARROLL M W，et al.Linezolid for treatment of chronic extensively drug-resistant tuberculosis［J］.N Engl J Med，2012，367（16）：1508-1518.DOI：10.1056/NEJMoa1201964.
［10］LEE M，CHO S N，BARRY C E 3rd，et al.Linezolid for XDR-TB—Final Study Outcomes［J］.N EnglJ Med，2015，373（3）：290-291.DOI：10.1056/NEJMc1500286.
［11］TANG S，YAO L，HAO X，et al.Efficacy，safety and tolerability of linezolid for the treatment of XDR-TB：a study in China［J］.Eur Respir J，2015，45（1）：161-170.DOI：10.1183/09031936.00035114.
［12］RAMÍREZ-LAPAUSA M，PASCUALPAREJA J F，CARRILLO GÓMEZ R，et al.Retrospective study of tolerability and efficacy of linezolid in patients with multidrug-resistant tuberculosis（1998—2014）［J］.Enferm Infecc Microbiol Clin，2015，34（2）：85-90.DOI：10.1016/j.eimc.2015.04.003.
［13］WILSON D N，SCHLUENZEN F，HARMS J M，et al.The oxazolidinone antibiotics perturb the ribosomal peptidyl-transferase center and effect tRNA positioning［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（36）：13339-13344.DOI：10.1073/pnas.0804276105.
［14］YATES J L，NOMURA M.E.coli ribosomal protein L4 is a feedback regulatory protein［J］.Cell，1980，21（2）：517-522.
［15］MAKAFE G G，CAO Y，TAN Y，et al.Role of the Cys154Arg Substitution in Ribosomal Protein L3 in Oxazolidinone Resistance in Mycobacterium tuberculosis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2016，60（5）：3202-3206.DOI：10.1128/AAC.00152-16.
［16］KLITGAARD R N，NTOKOU E，NØRGAARD K，et al.Mutations in the bacterial ribosomal protein l3 and their association with antibiotic resistance［J］.Antimicrob Agents Chemother，2015，59（6）：3518-3528.DOI：10.1128/AAC.00179-15.
［17］BECKERT P，HILLEMANN D，KOHL T A，et al.RplC T460C identified as a dominant mutation in linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis strains［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56（5）：2743-2745.DOI：10.1128/AAC.06227-11.
［18］ZHANG S，CHEN J，CUI P，et al.Mycobacterium tuberculosis Mutations Associated with Reduced Susceptibility to Linezolid［J］.Antimicrob Agents Chemother，2016，60（4）：2542-2544.DOI：10.1128/AAC.02941-15.
［19］ZIMENKOV D V，NOSOVA E Y，KULAGINA E V，et al.Examination of bedaquiline-and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region［J］.J Antimicrob Chemother，2017，72（7）：1901-1906.DOI：10.1093/jac/dkx094.
［20］PANG Y，ZONG Z，HUO F，et al.In vitro Drug Susceptibility of Bedaquiline，Delamanid，Linezolid，Clofazimine，Moxifloxacin，and Gatifloxacin against Extensively Drug-Resistant Tuberculosis in Beijing，China［J］.Antimicrob Agents Chemother，2017，61（10）.pii：e00900-17.DOI：10.1128/AAC.00900-17.
［21］胡明豪，王彬，付雷，等.体外诱导获取对利奈唑胺耐药的结核分枝杆菌菌株及其稳定性研究［J］.中国防痨杂志，2017，39（4）：397-401.DOI：10.3969/j.issn.1000-6621.2017.04.017.
［22］宗兆婧，荆玮，霍凤敏，等.广泛耐药结核分枝杆菌对利奈唑胺的耐药情况分析［J］.新发传染病电子杂志，2017，2（3）：160-163.DOI：10.3877/j.issn.2096-2738.2017.03.009.
［23］ZONG Z，JING W，SHI J，et al.Comparison of in Vitro Activity and MIC Distributions between the Novel Oxazolidinone Delpazolid and Linezolid against Multidrug-Resistant and Extensively Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis in China［J］.Antimicrob Agents Chemother，2018，62（8）.pii：e00165-18.DOI：10.1128/AAC.00165-18.
［24］YANG J S，KIM K J，CHOI H，et al.Delamanid，Bedaquiline，and Linezolid Minimum Inhibitory Concentration Distributions and Resistance-relatedGene Mutations in Multidrug-resistant and Extensively Drug-resistant Tuberculosis in Korea［J］.Ann Lab Med，2018，38（6）：563-568.DOI：10.3343/alm.2018.38.6.563.
［25］LONG K S，VESTER B.Resistance to linezolid caused by modifications at its binding site on the ribosome［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56（2）：603-612.DOI：10.1128/AAC.05702-11.
［26］HILLEMANN D，RÜSCH-GERDES S，RICHTER E.In vitro-selected linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis mutants［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52（2）：800-801.DOI：10.1128/AAC.01189-07.
（收稿日期：2018-10-12；修回日期：2018-11-16）
（本文编辑：鹿飞飞）