•结核病耐药专题研究•
结核分枝杆菌耐环丝氨酸相关基因研究进展
何兴，陈玲
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81760003）
563003贵州省遵义市，遵义医学院附属医院呼吸二科
通信作者：陈玲
何兴，陈玲.结核分枝杆菌耐环丝氨酸相关基因研究进展［J］.实用心脑肺血管病杂志，2018，26（11）：25-27，31.
HE X，CHEN L.Progress on drug resistance related genes of Mycobacterium tuberculosis to cycloserine［J］.Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2018，26（11）：25-27，31.
耐多药结核病（MDR-TB）指同时对利福平和异烟肼耐药的结核病。据统计，2017年全球范围内MDR-TB患者数量约为160 684例，其中广泛耐药结核病（XDR-TB）患者数量约占8.5%［1］，MDR-TB成为全球范围内结核病防控工作面临的主要挑战。环丝氨酸是1952年研发的一种抗生素，具有较强的抗结核分枝杆菌作用，因而WHO于2011年推荐环丝氨酸作为治疗MDR-TB的二线核心口服抗结核药物之一［2-4］。与其他抗结核药物相比，环丝氨酸耐药率较低，但近年来结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药增多。有研究者于1993—2007年对荷兰131例MDR-TB患者进行药敏试验发现，仅1例患者对环丝氨酸耐药，耐药率为0.8%［5］；2005年俄罗斯结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药率为7.4%；1995—2011年中国香港结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药率为8.6%［6］。在结核病治疗新药匮乏情况下，2012年5月国家食品药品监督管理局批准我国“全球基金耐多药结核病项目”开展地区使用环丝氨酸［7］。目前，结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药的具体机制尚未完全明确，本文综述了结核分枝杆菌耐环丝氨酸相关基因，旨在为结核分枝杆菌对环丝氨酸的耐药机制研究提供参考。
1 作用机制
环丝氨酸具有广谱抗菌作用，对多数革兰阴性菌及革兰阳性菌均具有一定抑制作用，对结核分枝杆菌具有较强的抑制作用并有利于防止结核分枝杆菌对丙硫异烟胺产生耐药［8］。自1999 年以来，伊朗、土耳其、印度等国家采用含环丝氨酸抗结核化疗方案治疗MDR-TB并取得良好效果。伊朗学者曾报道，采用含环丝氨酸抗结核化疗方案治疗的MDR-TB患者可达到治愈效果［9］；土耳其学者曾报道，采用含环丝氨酸抗结核化疗方案治疗的MDR-TB患者治愈率为77%［10］；日本学者曾报道，采用含环丝氨酸、吡嗪酰胺、乙胺丁醇等抗结核化疗方案治疗MDR-TB孕妇疗效确切［11］；西班牙学者曾报道，采用环丝氨酸、左氧氟沙星治疗的17例MDR-TB患者中12例达到治愈效果，且无复发或死亡患者［12］；印度学者曾报道，采用含环丝氨酸抗结核化疗方案治疗的39例MDR-TB患者中29例治疗6个月后痰菌转阴并维持到治疗结束［13］。
环丝氨酸抗结核分枝杆菌的血药浓度参考范围为1.5~30.0 mg/L［14］，其对体外H37Rv菌株的最低抑菌浓度（MIC）为25.0 mg/L［15］，环丝氨酸剂量为250.0~500.0 mg/次时血药峰浓度可维持在20.0~35.0 mg/L，不仅可发挥良好的抗结核分枝杆菌作用，还有利于减少不良反应的发生，因此血药峰浓度<15.0 mg/L时需增加环丝氨酸剂量，血药峰浓度>40.0 mg/L需减少环丝氨酸剂量［16］。
结核分枝杆菌细胞壁是一种网状复杂结构，主要由肽聚糖、霉菌酸、阿拉伯半乳聚糖等物质通过共价键连接而成，D-丙氨酸是结核分枝杆菌细胞壁中肽聚糖的重要成分［17］，丙氨酸消旋酶（Alr）是结核分枝杆菌细胞壁合成过程中必不可少的成分［5］，且Alr以磷酸毗哆醛（PLP）为辅酶催化L-丙氨酸和D-丙氨酸的转化；此外，在丙氨酸合成代谢途径中，丙氨酸连接酶催化二分子D-丙氨酸合成D-丙氨酸二聚体（ddl），因此丙氨酸连接酶在丙氨酸合成代谢中发挥着重要作用。环丝氨酸为D-丙氨酸结构类似物，主要通过抑制丙氨酸合成代谢途径中alr基因编码的Alr、ddlA基因编码的丙氨酸连接酶而减少肽聚糖的产生，继而抑制结核分枝杆菌细胞壁形成并减弱其耐酸能力，达到抗结核分枝杆菌的目的［18-19］。
2 耐药机制
目前已知的结核分枝杆菌耐环丝氨酸基因包括ald基因（Rv2780）、alr基因（Rv3423C）、cycA基因（Rv1704C）、ddlA基因（Rv2981C，ddl）等。
2.1 ald基因 ald基因ID为888493，全长1 116 bp，编码L-丙氨酸脱氢酶并参与丙氨酸代谢。研究发现，ald基因缺失的结核分枝杆菌无法将L-丙氨酸转化成丙酮酸并导致L-丙氨酸含量增加，而L-丙氨酸是环丝氨酸竞争性抑制物质前体，L-丙氨酸含量增加可能会导致Alr、丙氨酸连接酶持续活动而降低环丝氨酸的竞争性抑制作用，最终造成结核分枝杆菌产生大量肽聚糖并对环丝氨酸产生耐药性［19-20］。药敏试验结果证实，ald基因缺失与结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药有关，而补充ald基因后部分结核分枝杆菌会保存对环丝氨酸的敏感性［19-20］。
2.2 alr基因 alr基因ID为887634，全长1 227 bp，编码Alr并参与丙氨酸代谢途径中L-丙氨酸向D-丙氨酸的转化。研究发现，alr基因启动子突变的结核分枝杆菌对环丝氨酸的耐药性较高（MIC>60 μg/ml）［19］；D-丙氨酸消旋酶（alrA）过度表达可导致牛型分枝杆菌卡介苗对环丝氨酸产生耐药［21］，同时超量产生的突变体alrA启动子出现G-T置换可导致B-半乳糖苷酶基因表达［22］。DESIGARDINS等［23］研究发现，体外培养的alrA基因突变的结核分枝杆菌对环丝氨酸的耐药性增加。此外，还有研究证实结核分枝杆菌alrA非同义突变与环丝氨酸耐药表型有关［24-25］，有学者在24株耐环丝氨酸结核分枝杆菌中发现1株alrA同义突变，1株非同义突变，涉及的突变位点及氨基酸改变为261位丝氨酸-天冬酰胺，而对环丝氨酸敏感的结核分枝杆菌337位发生GGT-GGC，为甘氨酸同义突变［26］（见表1）。
2.3 cycA基因 cycA基因ID为888812，全长1 671 bp，编码D-丝氨酸、D-丙氨酸等运载通透蛋白并参与环丝氨酸的转运吸收［27］。BAISA等［28］研究发现，在甘油培养基和微量葡萄糖中大肠埃希菌cycA基因突变株CFT073和K-12对环丝氨酸的耐药性增加。目前研究已证实耐环丝氨酸大肠埃希菌变异株存在cycA基因单一位点突变［29］，早期曾有文献报道cycA基因点突变可导致大肠埃希菌对环丝氨酸的耐药性增加［30-31］，而在牛型分枝杆菌卡介苗中发现cycA基因非同义突变（Gly122Ser）可以解释部分环丝氨酸固有耐药现象［27］；FÉHERT等［29］对20株耐环丝氨酸大肠埃希菌进行研究发现，其cycA基因突变位点均不相同。此外，还有研究在24株耐环丝氨酸结核分枝杆菌中发现3株cycA基因同义突变，3株cycA基因非同义突变，其中非同义突变包括第188位CCT-GCT〔（脯氨酸-丙氨酸〕、第318位CGA-CTA〔精氨酸-亮氨酸〕及第508位GCA-TCA（丙氨酸-丝氨酸），但并未发现突变热点区域；在对环丝氨酸敏感的结核分枝杆菌中发现cycA基因第406位TCG-TCA（丝氨酸）及第521位CGT-CGC（精氨酸），均为同义突变［26］（见表1）。
2.4 ddlA基因 ddlA基因ID为888415，全长1 122 bp，编码丙氨酸连接酶并催化二分子D-丙氨酸合成ddl、参与丙氨酸代谢。20世纪70年代，有学者对耐环丝氨酸结核分枝杆菌突变体进行分离发现，ddlA基因对环丝氨酸的抗结核分枝杆菌作用影响极小，但后续研究发现ddlA基因、alr基因同时过度表达可导致结核分枝杆菌对环丝氨酸的耐药性增加［32］。有研究在24株耐环丝氨酸结核分枝杆菌中发现1株ddlA基因同义突变，为第92位CGT-CGC突变（精氨酸）（见表1）［26］。
表1 已知的环丝氨酸耐药基因突变类型、氨基酸改变及MIC
Table 1 Known drug resistance related gene mutation types to cycloserine，changes of amino acids and the MIC
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基因突变类型（氨基酸改变）
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突变频
率（n/N）
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MIC
（μg/ml）
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参考文献
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alr基因
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第261位AGC-AAC（Ser-Asn）a
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1/24
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32
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李超等［26］
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第337位GGT-GGC（Gly）b
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1/24
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8
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李超等［26］
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CTG-ATG（Leu-Met）a
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NA
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NA
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MURRAY［22］
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cycA基因
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第188位CCT-GCT（Pro-Ala）a
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1/24
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32
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李超等［26］
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第318位CGA-CTA（Arg-Leu）a
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1/24
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32
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李超等［26］
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第406位TCG-TCA（Ser）b
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2/24
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4~8
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李超等［26］
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第508 位GCA-TCA（Ala-Ser）a
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1/24
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32
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李超等［26］
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第521位CGT-CGC（Arg）b
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1/24
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2
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李超等［26］
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ddlA基因
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第92位CGT-CGC（Arg）b
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1/24
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16
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李超等［26］
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注：n/N=基因突变菌株/检测菌株，MIC=最低抑菌浓度，Ser=丝氨酸，Asn=天冬酰胺，Gly=甘氨酸，Leu=亮氨酸，Met=甲硫氨酸，Pro=脯氨酸，Ala=丙氨酸，Arg=精氨酸；NA表示未提及或无相关数据；a为非同义突变，b为同义突变
3 小结与展望
综上所述，环丝氨酸作为二线核心抗结核口服药物，具有独特的结构及作用机制，治疗耐药结核病的前景广阔，但其耐药现象不容忽视，应深入研究其耐药机制以减少耐药的发生。近年来随着对结核分枝杆菌耐药机制的研究深入，发现耻垢分枝杆菌中Alr及丙氨酸连接酶过表达会产生对环丝氨酸的耐药性，且Alr对环丝氨酸耐药性的影响程度较丙氨酸连接酶高［33］，而alr基因、ddlA基因突变与结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药有关［21，34-35］；此外，卡介苗丝氨酸运载体突变也可导致结核分枝杆菌对环丝氨酸产生耐药性［27，33］。
目前，基因突变可以解释部分结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药，其中ald基因、alr基因、cycA基因、ddlA基因突变导致结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药已达成一定共识，但各研究中所涉及的突变位点均不相同，因此还可能存在其他突变位点、耐药靶酶等，因此，结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药的具体机制等仍需进一步研究证实。
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（收稿日期：2018-10-13；修回日期：2018-11-18）
（本文编辑：鹿飞飞）