实用心脑肺血管病杂志

·论著·

慢性阻塞性肺疾病患者外周血核苷酸结合寡聚化结构域2、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3及下游炎性因子表达情况及其关系研究

 

宋 珊，贾钦尧，陈绍平，毛 建，韩美玲，廖俊蕾

 

基金项目：四川省教育厅基金资助项目（16ZB0230）

637000四川省南充市，川北医学院附属医院呼吸内科

通信作者：陈绍平，E-mail：chenshaoping836@163.com

 

DOI:10.3969/j.issn.1008-5971.2017.09.010

 

宋珊，贾钦尧，陈绍平，等.慢性阻塞性肺疾病患者外周血核苷酸结合寡聚化结构域2、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3及下游炎性因子表达情况及其关系研究［J］.实用心脑肺血管病杂志，2017，25（9）：42-46.

SONG S，JIA Q R，CHEN S P，et al.Peripheral blood expressions of NOD2，NLRP3 and downstream inflammatory cytokines in patients with COPD and their correlations［J］.Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2017，25（9）：42-46.

 

    慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种慢性炎性疾病，主要特征为持续性气流受限，存在不同程度的气道损伤、肺功能下降及免疫功能异常^［1］。COPD的发病机制较为复杂，目前尚无确切发病机制。研究表明，固有免疫与慢性阻塞性肺疾病急性发作期（AECOPD）有关^［2］。

    核苷酸结合寡聚化结构域2（NOD2）和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）均属于细胞内模式识别受体-NOD样受体（NLRs）家族，在机体固有免疫中发挥着重要作用。研究表明，NOD2通过激活核因子κB（NF-κB）而启动炎性反应，NLRP3激活后形成NLRP3炎性小体能活化促炎蛋白酶，两者均通过介导下游炎性因子〔白介素1β（IL-1β）、白介素18（IL-18）〕而参与炎性反应过程^［3］；NOD2和NLRP3作为机体固有免疫系统的重要防御成分，可参与多种疾病的发生发展过程^［4］。本研究旨在探讨NOD2、NLRP3及下游炎性因子在COPD患者外周血中的表达及关系，现报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料  选取2015年1月—2017年1月川北医学院附属医院收治的COPD患者200例，均符合中华医学会呼吸病学分会制定的COPD诊断标准。纳入标准：（1）沙丁胺醇支气管扩张试验阴性；（2）未使用影响白三烯代谢药物；（3）能配合肺功能检查。排除标准：（1）合并支气管哮喘、肺纤维化、支气管扩张、肺结核等肺部疾病者；（2）合并气胸、大咯血及胸腔积液者；（3）近期（4周内）行胸腹手术者；（4）合并心力衰竭者；（5）不宜行肺功能检查及长期接受糖皮质激素治疗者。其中AECOPD患者100例作为A组，COPD缓解期患者100例作为B组。A组患者中男56例，女44例；年龄52～80岁，平均年龄（68.3±5.2）岁。B组患者中男59例，女41例；年龄54～79岁，平均年龄（69.1±5.5）岁。根据病情将B组患者分为低风险组（肺功能分级Ⅰ～Ⅱ级，1年内急性发作≤1次）与高风险组（肺功能分级Ⅲ～Ⅳ级，1年内急性发作≥2次），每组50例。低风险组中男28例，女22例；年龄56～82岁，平均年龄（70.3±5.2）岁。高风险组中男27例，女23例；年龄55～84岁，平均年龄（70.6±5.8）岁。另选取同期于川北医学院附属医院体检健康者100例作为对照组，其中男55例，女45例；年龄52～82岁，平均年龄（69.4±5.8）岁；肺功能正常；无吸烟史；近期（4周内）无呼吸系统疾病症状。A组、B组和对照组受试者性别（χ²=0.35）、年龄（F=1.07）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经川北医学院附属医院医学伦理委员会审核批准，受试者及其家属均签署知情同意书。

1.2  方法

1.2.1  仪器与试剂  低温高速离心机（德国Legend RT公司生产），Elx 800酶标仪（美国BioTek公司生产），ABI 7300型荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司生产），HP-Deskjet 3748肺功能仪（德国耶格公司生产）。磷酸盐缓冲液（PBS）（北京中杉金桥生物技术有限公司生产），人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物公司生产），Trizol（美国Invitrogen公司生产），三氯甲烷（上海迈瑞尔化学技术有限公司生产），异丙醇（上海迈瑞尔化学技术有限公司生产），无水乙醇（上海迈瑞尔化学技术有限公司生产），焦碳酸二乙酯（DEPC）（Gibco公司生产），反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购自日本Taka Ra公司（由上海生工生物公司合成所需引物），聚合酶链反应（PCR）所需试剂由美国Invitrogen公司提供，酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。

1.2.2  标本采集与外周血单个核细胞（PBMCs）分离  采集所有受试者清晨空腹外周血5 ml，置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）的真空采血管中，于4 ℃保存；后以3 000 r/min离心10 min，取上清，置于-80 ℃保存；使用吸管吸取血清1 ml置于加入0.01M PBS 1 ml离心管，反复吹打，混匀；将混悬液转移至15 ml离心管，加入人淋巴细胞分离液2 ml，2 000 r/min离心15 min，分4层，取第2层（即PBMCs）置于1.5 ml去酶EP管中，后继续加入一定量的0.01M PBS，3 000 r/min离心10 min，弃上清，经2次洗涤后留沉淀备用，再继续加入Trizol 1 ml，反复吹打后于室温下静置5 min，于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.2.3  RNA提取及RT-PCR  （1）RNA提取采用Trizol法，取PBMCs，加入三氯甲烷200 μl（按Trizol∶三氯甲烷=1∶5），剧烈振荡后静置5 min，于4 ℃环境下以12 000 r/min离心10 min，取上层水相400 μl，置于1.5 ml EP管中；加入异丙醇400 μl，轻轻振荡后静置5 min，于4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，弃上清；加入75%乙醇1 ml进行洗涤，于4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，弃上清，洗涤2次，后将EP管风干，加入0.1% DEPC 20 μl，反复吹打，溶解沉淀，将提取的RNA置于-80 ℃超低温冰箱保存。（2）RT-PCR采用SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒（日本Taka Ra公司生产），反应体系为20 μl/孔，包括SYBR Green Premix Ex Taq 10 μl、ROX Reference Dyell（50x）0.4 μl、PCR Reverse Primer（10 μM）0.3 μl、PCR Forward Primer（10 μM）0.3 μl 、DNA模板2 μl、灭菌蒸馏水7 μl；反应条件：94 ℃预变性4 min进入主循环，其中94 ℃预变性30 s，56 ℃变性60 s，72 ℃延伸40 s，经40个循环；记录循环次数（CT值），并计算NOD2 mRNA和NLRP3 mRNA表达量。NOD2正向引物序列为5＇-CACCCTGACCGTGTCCTGT-3＇，反向引物序列为5＇-CACCTTGCGGGCATTCTT-3＇，扩增长度为159 bp；NLRP3正向引物序列为5＇-CTTCCTTTCCAGTTTGCTGC-3＇，反向引物序列为5＇-TCTCGCAGTCCACTTCCTTT-3＇，扩增长度为212 bp。

1.2.4  血清IL-1β、IL-18水平  采集所有受试者清晨空腹外周血5 ml，3 000 r/min离心10 min，取上清，置于-80 ℃环境下保存待测，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，显色后在Elx 800酶标仪下进行光密度（OD）值测定，波长为450 nm，根据OD值作出标准曲线，并计算样本浓度。

1.2.5  肺功能指标  检查前24 h停用长效支气管扩张剂，检查前12 h停用短效β₂-受体激动剂，吸入沙丁胺醇200 μg，15 min后采用HP-Deskjet 3748肺功能仪检查肺功能指标〔第1秒用力呼气容积（FEV₁）、用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼气容积与用力肺活量比值（FEV₁/FVC）、第1秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV₁%）〕，测量3次取平均值。

1.3  统计学方法  采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验；计数资料分析采用χ²检验；相关性分析采用Pearson相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1  对照组、A组、B组受试者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平比较  3组受试者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组、B组患者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组患者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2  对照组、低风险组、高风险组受试者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平比较  3组受试者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；低风险组、高风险组患者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；高风险组患者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平高于低风险组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.3  NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量与血清IL-1β水平、血清IL-18水平、FEV₁/FVC、FEV1%的相关性  Pearson相关性分析结果显示，NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量与COPD患者血清IL-1β水平（r值分别为0.625、0.656）、血清IL-18水平（r值分别为0.701、0.723）呈正相关，与FEV₁/FVC（r值分别为-0.389、-0.415）、FEV₁%（r值分别为-0.513、-0.558）呈负相关（P＜0.05）。

3  讨论

    COPD发病机制复杂，炎症是其中心环节，临床常表现为气道、肺实质的慢性炎性反应，且炎性反应反复发生可损伤气道，导致气道重塑^［5］。吸烟、烟雾、有害气体和病原微生物感染可导致气道炎症和损伤的发生，是COPD发生发展的影响因素^［6］。

    固有免疫能有效清除病原体及外源性有害物质，其中病原体的保守结构〔即病原体相关分子模式（PAMPs）〕识别可通过模式识别受体（PRRs）实现，PRRs和PAMPs相互作用可激活下游信号通路，介导多种炎性因子分泌和释放，从而引发炎性反应及免疫应答^［7］。PRRs包括Toll样受体、NLRs等，目前研究较多的NLRs家族成员主要包括NOD2、NLRP3等^［8］。NOD2与其特异性配体结合后可激活NFκB经典信号通路和丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路，产生大量促炎因子，导致炎性反应；同时激活NF-κB可增强NOD2 mRNA表达，促进促炎因子前体转录，使促炎因子分泌，具有调控炎性反应的作用^［9］。NLRP3经PAMPs激活后耦联酶和相关蛋白形成NLRP3炎性小体，可参与机体固有免疫过程，在多种炎性反应中发挥了重要作用；同时，NLRP3炎性小体可在多种危险信号下被激活，调控IL-1β和IL-18 前体分泌，从而介导下游炎性反应发生。

    本研究结果显示，A组、B组患者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平高于对照组，A组患者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平高于B组，与既往研究结果一致^［10-12］，提示COPD患者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平较高，且AECOPD患者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平更高；低风险组、高风险组患者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平高于对照组，高风险组患者NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平高于低风险组，与既往研究结果一致^［13］。研究表明，COPD患者由于感染、烟雾及有害气体等刺激而导致NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量、血清IL-1β和IL-18水平升高，引发炎性反应，造成患者病情进展^［14-15］。Pearson相关性分析结果显示，NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量与COPD患者血清IL-1β、IL-18水平呈正相关，与FEV₁/FVC、FEV1%呈负相关，提示NOD2、NLRP3可参与COPD患者炎性反应过程，可影响患者肺功能。

    综上所述，COPD患者外周血NOD2、NLRP3表达水平及血清IL-1β、IL-18水平较高，且NOD2 mRNA表达量、NLRP3 mRNA表达量与COPD患者血清IL-1β、IL-18水平及肺功能有关。但本研究样本量较小，且研究对象多为中老年人，结果结论存在一定局限性，而NOD2、NLRP3影响COPD患者肺功能的具体机制仍有待扩大样本量进一步深入研究。

    作者贡献：宋珊进行文章的构思与设计，撰写论文；陈绍平进行研究的实施与可行性分析，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理；毛建、韩美玲、廖俊蕾进行数据收集、整理、分析；贾钦尧进行结果分析与解释；贾钦尧、韩美玲进行论文的修订；廖俊蕾进行英文的修订。

    本文无利益冲突。

参考文献

［1］杨其彬，周京国，青玉凤，等.痛风性关节炎患者外周血单个核细胞NLRP3炎性体mRNA表达的研究［J］.中华风湿病学杂志，2010，14（10）：686-689.DOI：10.3760/cma.j.issn.1007-7480.2010.10.008.

［2］毛建，宋珊，贾钦尧，等.慢性阻塞性肺疾病患者外周血淋巴细胞NLRP3 mRNA的表达及血清IL-1β、IL-18检测的意义［J］.临床肺科杂志，2017，22（6）：1060-1063.DOI：10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.026.

［3］黄巧玲，覃聪，黄广群，等.NLRP3炎症小体及其下游炎症因子在动脉粥样硬化炎症反应中的作用［J］.海南医学，2017，28（1）：86-88.DOI：10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.026.

［4］丁焕发，徐晓辰，王尚云，等.急性痛风性关节炎患者治疗前后外周血单核细胞NLRP3炎性体mRNA表达及血清IL-18水平的研究［J］.中国医药指南，2016，14（14）：1-3.

［5］孙志芬,张媚霞,曲桂红,等. 噻托溴铵治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期的临床疗效及对血清白介素18、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶9水平的影响研究［J］. 实用心脑肺血管病杂志,2016,24(8):50-53.

［6］陈愉生,陈小燕,陈正伟,等.单纯烟雾暴露建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的方法学研究［J］.实用心脑肺血管病杂志,2016,24(10):58-62.DOI:10.3969/j.issn.1008-5971.2016.10.016.

［7］王国强，牟佳，李元，等.NLRP3、AIM2和CASP1基因在慢性阻塞性肺疾病急性加重发病中的作用［J］.吉林大学学报（医学版），2016，42（1）：130-133.DOI：10.13481/j.1671-587x.20160126.

［8］田岚.痛风性关节炎患者外周血单个核细胞中TRF1、TRF2及NLRP3炎性体的变化［J］.中国医药导报，2015，12（34）：82-85.

［9］韩浩贤，王虹艳，曲鹏，等.NLRP3与NOD2受体激活对下游炎症因子表达的影响［J］.重庆医学，2016，45（23）：3182-3184.DOI：10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.005.

［10］王金凤.NOD1、NOD2及NLRP3炎症小体在肺部疾病中的研究进展［D］.兰州：兰州大学，2013.

［11］贾钦尧，陈绍平，李新胜，等.慢性阻塞性肺疾病患者外周血单个核细胞NOD2 mRNA表达及白细胞介素-6的水平及意义［J］.中国老年学杂志，2017，37（14）：3529-3531.

［12］杨其彬.NLRP3炎性体信号通路在急性痛风性关节炎患者中变化的研究［D］.南充：川北医学院，2011.

［13］王师，王华英，翁跃颂，等.NLRP3炎症小体通路在慢性阻塞性肺病发展中的作用研究［J］.浙江医学，2017，39（1）：32-36.

［14］HAMMAD D R，ELGAZZAR A G，ESSAWY T S，et al.Evaluation of serum interleukin-1 beta as an inflammatory marker in COPD patients［J］.Egyptian Journal of Chest Diseases and Tuberculosis，2015，64（2）：347-352.DOI：10.1016/j.ejcdt.2015.01.005.

［15］王莉莉.NLRP3炎症小体及其下游炎症因子在动脉粥样硬化炎症反应中的作用［D］.大连：大连医科大学，2013.

（收稿日期：2017-06-01；修回日期：2017-08-29）

（本文编辑：李洁晨）